Directo a los genes - Comportamientos y Neurogenética
En el último post hablamos sobre los primeros estudios enfocados en descifrar si los comportamientos están determinados por la información genética y cómo. Estos estudios se dieron en el contexto de una revolución en la ciencia, particularmente en la biología, desencadenada por el descubrimiento de las leyes mendelianas de herencia y su relación con la explicación de la evolución propuesta por Darwin (la selección natural).
Hablamos también sobre la perversión de este tema de estudio y su uso como base para una pseudociencia llamada eugenesia, la cual justificaba la discriminación, la estigmatización y la eliminación total de grupos específicos de la sociedad que consideraban inadecuados e indeseables en el grupo genético de la humanidad. La eugenesia fue una interpretación errónea de datos científicos con el fin de justificar viejos prejuicios. Condujo a la muerte de millones de seres humanos.
Luego de esos días oscuros, el estudio del comportamiento se enfocó en la influencia del entorno (ambiente) sobre él. Algunos investigadores fueron hasta el otro extremo y propusieron que los comportamientos eran un producto del medio ambiente y que la genética no tenía ninguna influencia.
Finalmente, a finales de los años 50, Hirsch realizó complejos experimentos de selección con moscas que demostraron que los comportamientos estereotipados de las moscas tenían un componente genético que podía aislarse y asignarse a cromosomas específicos y partes de los cromosomas. Los comportamientos son complejos, variables y tienen un componente genético en donde muchos genes están, probablemente, involucrados en un comportamiento particular.
Pero entonces, ¿cómo continuó esta historia?
Seymour Benzer - La revolución molecular llega a los comportamientos
A principios de la década de los 50s, la biología pasó por otra revolución, la revolución molecular. Se estableció que el ADN era la fuente de información genética y se descifró su estructura molecular, lo que permitió comprender sus mecanismos de replicación y su relación con la producción de ARN (transcripción). Otros estudios determinaron algunos mecanismos de regulación y la relación del ADN y el ARN con las proteínas (puede volver a visitar mi versión conceptual del ADN).
Entre los científicos que hicieron estos increíbles descubrimientos estuvo Seymour Benzer. Benzer era un físico que se metió en la biología después de leer un libro de otro físico, Erwin Schrödinger (el del gato en la caja) en el que proponía cuáles tenían que ser las propiedades de una molécula que tuviese información hereditaria (años antes de que la estructura del ADN fuese descripta).
Benzer se interesó en investigar la estructura molecular del gen y como es que contiene información para formar un organismo. Trabajó en el laboratorio de Max Delbruck (luego galardonado con el Premio Nobel) con un tipo de virus que infecta bacterias conocido como fago. En sus experimentos usó la misma lógica que se había aplicado en el laboratorio de Morgan para enteder la estructura lineal de los cromosomas, pero en una menor escala. Benzer describió la estructura del gen. Demostró que un gen es una molécula lineal, y que las mutaciones pueden ser modificaciones tan pequeñas como un cambio en un elemento básico del ADN (recuerden las “letras” o los círculos de color en el esquema conceptual).
Max Delbruck dirigía unas reuniones informales de científicos de diferentes laboratorios llamado el Grupo Fago. Todos usaban bacterias y virus del tipo fago como modelos para comprender los mecanismos moleculares de la información genética. Hicieron descubrimientos fundamentales que iniciaron el revolucionario campo de la biología molecular. Entre estos científicos se encontraban Salvador Luria, Alfred Hershey, Matthew Meselson, James Watson, Renato Dulbecco, Seymour Benzer and Sydney Brenner.
Después de ese trabajo, Benzer estableció su propio laboratorio. Esta vez se interesó en el estudio del comportamiento, particularmente en cómo las piezas que forman un organismo pueden producir un comportamiento. Él había leído otro libro, esta vez sobre los descubrimientos en neurología y anatomía en relación con los comportamientos (la Maquinaria del Cerebro de DE Wooldridge). En ese libro se presentaban muchos casos en los que se mostraba cómo partes del cerebro, nervios específicos y ciertas conexiones están involucrados en la percepción del mundo. El libro describía cómo desconectando o dañando partes o nervios específicos podía producir cambios en los comportamientos. Con su experiencia en biología molecular y genes, decidió poner a prueba la vieja pregunta sobre si los genes controlan los comportamientos y cómo.
Benzer trabajaba en el mismo instituto donde Morgan había tenido su cuarto de moscas. Allí, EB Lewis, un discípulo de Sturtevant, seguía trabajando con moscas y manteniendo la colección de mutantes (Lewis había hecho sorprendentes descubrimientos en biología del desarrollo). Benzer ideó un enfoque experimental que permitía encontrar genes individuales involucrados en el control de comportamientos específicos. Viendo las moscas de Lewis, se dió cuenta de que eran el modelo animal indicado para llevarlo a la práctica.
Su enfoque experimental necesitaba de:
- Un método fácil de hacer mutación en genes aleatorios.
- Mutaciones en genes individuales (en oposición al daño grave a muchos genes a la vez).
- Obtener un gran número de animales muy rápidamente.
- Comportamientos que fueran simples, fáciles de estudiar y de medir.
Su enfoque es conocido, hoy en día, como Genética Directa y permite descubrir genes que controlan procesos biológicos. Este enfoque se centra en el proceso biológico y trata de desarmarlo para revelar sus componentes fundamentales.
Se puede desglosar en pasos:
PRIMERO
Establecer un fenómeno biológico observable definido que se repite regularmente y que queremos estudiar. Por ejemplo, un comportamiento específico.
Benzer eligió el comportamiento fototáctico de las moscas. Las moscas se mueven hacia las fuentes de luz.
SEGUNDO
Diseñar una manera experimental de describir o medir este fenómeno (este comportamiento).
Benzer fabricó un dispositivo llamado Aparato de Contracorriente (el nombre proviene de una técnica química para separar líquidos mezclados que utiliza una lógica similar).
En este video pueden ver este aparato en uso, pero para estudiar otro comportamiento, el de geotaxis negativa (el movimiento en contra de la gravedad, alejandose del suelo). En fototaxis el aparato se coloca horizontalmente apuntando uno de sus extremos hacia una fuente de luz.
Benzer probó que su aparato funcionaba usando controles positivos, es decir sujetos (en este caso, moscas) que ya sabemos que se comportan de manera diferente a los sujetos normales (moscas). En este caso, Benzer usó como control positivo, moscas con las alas cortadas. Ya se sabían con anterioridad que esas moscas tenían una menor atracción hacia la luz.
Su aparato consistía en dos filas de 15 tubos de vidrio capaces de deslizarse uno delante de otro para conectar las aberturas de los tubos de ambas filas. El aparato se coloca horizontalmente, con una fila delantera de tubos cerca de una fuente de luz y una fila posterior de tubos más alejada de la fuente de luz.
Para entender cómo funciona, llamemos a la fila delantera con letras de A-B-C-D… y la fila posterior con los números 1-2-3-4…
Las moscas comienzan en el primer tubo de la fila posterior, el tubo 1. Entonces se conecta al tubo 1 el primer tubo de la fila delantera, el tubo A. Se ilumina desde el lado de los tubos con letras y las moscas comenzarán a moverse hacia la luz (del tubo 1 al tubo A).
Después de un tiempo, deslizamos la fila delantera hacia la derecha para conectar A con 2. Se transfieren entonces las moscas que se eoncuentan en A a los tubos posteriores (el tubo 2) colocando el aparato verticalmente y golpeándolo contra la mesa (de esta manera las moscas caen a los tubos posteriores). Luego deslizamos la fila delantera nuevamente hacia la izquierda, conectando A con 1, B con 2, etc.
Después de eso volvemos a encender la luz, y repetimos. A medida que los ciclos continúan, las moscas se atraen por la luz y serán sucesivamente desplazadas hacia los tubos de la derecha. Si las moscas son muy lentas para moverse o no son atraídas por la luz, se irán quedando atrás y permanecerán en los primeros tubos (los de la izquierda).
Al final del experimento, si las moscas son normales y se encuentran muy atraídas por la luz, los tubos del final de las filas (los últimos de la derecha) tendrán más moscas que los que se encuentran al principio (A y 1).
TERCERO
Generar variantes de los organismos (llamados líneas o stocks de moscas) que tienen mutaciones en genes individuales al azar.
Guiado por Lewis, Benzer usó una sustancia química (etil metano sulfonato o EMS) que puede generar daños sutiles en el ADN; mutaciones en genes individuales.
CUARTO
Analizar los mutantes con el dispositivo o método.
Una vez establecidas las líneas mutantes, Benzer las testeó con el aparato y el procedimiento descripto. Las moscas con mutaciones en los genes importantes para el comportamiento de la fototaxis, mostrarían una atracción reducida a la luz y terminarían en los primeros tubos a la izquierda de cada fila, más cerca del punto de partida.
Benzer estableció 26 líneas mutantes y encontró 2 buenos candidatos que no se movían hacia la luz.
Este método puede pensarse como romper las piezas de una máquina de a una por vez para ver cuál pieza hace que la máquina funcione mal o deje de funcionar.
Pero, ¿qué pasa si, como en los experimentos de Benzer, se tocan las piezas sin saber realmente cuáles se están rompiendo? En ese caso, luego del experimento, se debe encontrar una manera de determinar qué piezas se rompieron (sería como abrir la máquina y observarla). Gracias a cruzas genéticas, similares a las que hacía Mendel o Morgan (una técnica llamada mapeo genético que explicaré en el futuro), Benzer pudo determinar dónde se encontraban localizadas en el genoma las mutaciones.
En 1967 Benzer publicó sus resultados. El suyo fue un trabajo seminal que demostró que los genes individuales pueden controlar los comportamientos, y proporcionó la prueba conceptual de cómo descubrir genes para otros comportamientos utilizando el enfoque de la genética directa (muy útil también para estudiar otros procesos biológicos. Veremos mucho de esto en futuras publicaciones).
El trabajo de Hirsch había demostrado que había genes en todo el genoma involucrados en comportamientos, es decir, que los comportamientos eran fenómenos complejos controlados de una manera multigénica. Esto resultaba muy importante en el contexto de los experimentos de Benzer. Dado que Benzer estaba interesado en descubrir genes individuales involucrados en el comportamiento, tenía que asegurarse de que sus líneas no tuvieran diferencias en ninguna otra parte del genoma.
En otras palabras, Benzer tenía que asegurarse de que la única variable que distinguiera las moscas analizadas fueran las mutaciones únicas que estaba probando (recuerda lo que nos enseñó el querido Francesco Redi). Para evitar los efectos de más de un gen desconocido, el resto del genoma tenía que ser idéntico (a esto le llamamos un fondo genético isogénico).
Para asegurarse de esto, Benzer usó una única línea de moscas para producir los mutantes. Eligió esa línea porque ya había sido analizada y seleccionada por su muy buen rendimiento en el comportamiento de fototaxis. Benzer usó esta misma línea más adelante como control en todos sus experimentos. Hoy en día es ampliamente utilizada en experimentos de comportamiento en muchos laboratorios.
No hay tiempo que perder - La genética del reloj biológico
Después de la publicación de Benzer, Ron Konopka se unió a su laboratorio como estudiante de doctorado. Estaba interesado en utilizar el enfoque de Benzer para estudiar el reloj biológico interno.
¿Qué es esto?
Prácticamente todos los organismos vivos estudiados hasta ahora tienen, en alguna medida, la capacidad de medir el paso del tiempo. Muchas plantas abren y cierran sus hojas o flores siguiendo los ritmos del día y de la noche. Muchos animales se preparan para dormirse o despertarse, modulando progresivamente sus niveles de actividad con los ciclos del día y la noche. Estos patrones de actividad rítmica se conocen como ritmos circadianos porque se repiten con un período de alrededor de 24 hs (“circa” significa “cerca de” y “dian” se refiere a “la duración de un día”).
Para ese entonces, ya se sabía que los animales y las plantas pueden mantener ese ritmo de alrededor de un día y realizar ciclos de períodos de actividad alta y baja, incluso en ausencia de claves del entorno, como ser los ciclos de horas de luz solar, o en situaciones de temperatura diaria constante o mismo sin la influencia de la rotación de la tierra. En muchos casos, también se había demostrado que estos patrones de actividad rítmica eran innatos y no se aprendían de los padres u otros organismos.
Entonces, si los cambios rítmicos en la actividad no provienen del ambiente (desde afuera) y son innatos (hereditarios), entonces debería haber un mecanismo interno que lo controlara y el mismo tendría que estar codificado en los genes. Como es de esperar, llamamos a este mecanismo interno, el reloj interno.
Para Ron Konopka, el enfoque de Benzer era la forma perfecta de romper el reloj y ver de qué estaba hecho.
PRIMERO
¿Qué comportamiento rítmico estudiamos entonces?
Durante el ciclo de vida de la mosca hay un período llamado metamorfosis, cuando la larva se convierte en una pupa para transformarse en una mosca adulta. Esta transformación ocurre dentro del pupario, una estructura de cápsula dura que forma la cáscara de la pupa. Cuando termina la transformación, la mosca adulta rompe la cápsula y emerge al mundo exterior. Si tenemos un grupo de pupas, la mayoría emergerá temprano en la mañana y unas pocas lo hará a medida que el día continúe.
En la investigación con moscas se hacen cruzas genéticas donde se aparean moscas macho con moscas hembras vírgenes. Esto se debe a que cuando las moscas copulan, la hembra almacena el esperma del macho para fecundar los huevos a medida que los va produciendo. De esta manera, una hembra que no es virgen tendrá esperma de machos desconocidos dentro de ella, arruinando los resultados de las cruzas.
Para obtener hembras vírgenes para experimentos, el mejor momento del día es temprano en la mañana, cuando recién emergen y la virginidad está asegurada. Es muy común ver el cuarto de moscas lleno de gente durante la mañana, mientras que unos esperan con impaciencia su turno para usar los microscopios para juntar esas codiciadas vírgenes.
SECOND
¿Cómo medimos este comportamiento?
Esto se puede cuantificar revisando las botellas o los viales de moscas a distintos momentos del día y contando puparios vacíos o adultos recién emergidos.
TERCERO y CUARTO
Luego, Ron Konopka generó moscas mutantes de la misma manera que Benzer había hecho y analizó si esos mutantes cambiaban su patrón de emergencia del pupario a lo largo del día respecto de las moscas normales. Konopka analizó 200 líneas mutantes y encontró tres líneas interesantes: una en donde la mayoría de las moscas emergía en promedio 5 horas antes que las moscas normales, otra que emergía 5 horas más tarde y una tercera que no tenía un ritmo específico para la emergencia y en la población había moscas emergiendo durante todo el día y la noche.
¡Muy emocionante! ¡Esto podría ser un verdadero control genético del comportamiento!
Periodo. Tres alelos de un componente central del reloj.
¿Son estos mutantes realmente mutantes del “reloj”? ¿Presentan alteraciones más allá de la emergencia del pupario? ¿Cómo se comportan durante la vida adulta? ¿Tienen un sentido del tiempo alterado? ¿Cómo saberlo?
Durante la pausa para almorzar, Konopka habló sobre esto con sus colegas y su jefe. Benzer hizo uso de su ingenio y experiencia en la física. Propuso usar un espectrofotómetro para medir cuánto se mueven las moscas durante el día (esto se llama actividad locomotora).
Un espectrofotómetro utiliza luz de colores específicos para cuantificar la concentración de sustancias diluidas en líquidos. Pero la parte importante para nosotros es que esta máquina emite una luz desde un lado de un tubo y mide su intensidad con un sensor en el otro lado del tubo. Si la luz está bloqueada, el sensor lo detecta y la máquina registra esa señal. ¿Qué puede bloquear la luz? ¡Pues una mosca moviéndose dentro del tubo!
Luego de unos cuantos intentos con el espectrofotómetro, vieron que la idea podía funcionar. Entonces uno de los investigadores del laboratorio armó un aparato especifico para usar con las moscas.
Usaron tubos angostos con un poco de comida de mosca en un extremo y un tapón en el otro, en los que la mosca no puede volar pero sólo caminar de un extremo al otro. Usaron luz infrarroja (que las moscas no pueden ver) y un sensor de luz infrarroja para medir cuanto se movían las mocas durante el día de manera automatizada. Cuando la mosca se mueve atravesando el haz de luz infrarroja en el centro del tubo el sensor lo detecta y graba una señal (muy parecido a los haces de luz de los sistemas de seguridad en las películas de asaltos).
En los momentos de alta actividad durante el día, la mosca camina más y pasa a través del haz de luz más seguido. Durante los momentos de menos actividad, la mosca camina menos y no cruza el haz tan frecuentemente
Las moscas normales tienen mucha actividad en la mañana, luego realizan una siesta a la tarde y reducen su actividad. Después vuelven a la actividad poco antes del atardecer y finalmente pasan la noche tranquilas durmiendo (¿duermen realmente? Y si duermen, ¿por qué necesitan hacerlo? Tal vez podamos hablar de eso algún otro día).
Esto sucede incluso en la oscuridad total y a temperatura constante porque este ciclo está controlado por el reloj interno. En los fenómenos cíclicos, la duración de una vuelta completa del ciclo se denomina período y define el día que la mosca percibe. Una mosca normal tiene un período de alrededor de 24 hs, un día normal en el planeta Tierra.
Konopka y Benzer observaron que dos de los mutantes se comportaban como las moscas normales. Pero uno de ellos parecía tener una percepción del día más larga de lo normal. En lugar de tener períodos de actividad de 24 horas para ese mutante los períodos eran más largos y duraban como si el día tuviese 29 horas. El otro tenía el efecto contrario y con periodos más cortos, su percepción del día era de 19 hs. El tercer mutante simplemente no tenía ningún período, y su actividad no tenía ritmo, era un mutante arrítmico.
La siguiente pregunta fue: ¿en qué lugar del genoma se ubican esas mutaciones? Para responder a esto, Konopka mapeó el gen y se dió con una sorpresa increíble. El mapeo indicaba que los tres mutantes, el de período corto, el de período largo y el arrítmico, estaban ubicados en el mismo locus (llamamos locus a una región genómica de interés), ¡esto significaba que eran mutaciones diferentes en el mismo único gen!
Habían encontrado un solo gen que controlaba la duración del período interno del día de la mosca. En la investigación de Drosophila, cuando se descubre un nuevo gen, se le da un nombre, generalmente en referencia a su función o al efecto de las mutaciones en el gen. Konopka y Benzer llamaron a este nuevo gen Período (en inglés, Period).
¿Qué significa el descubrimiento de Period para la relación entre la genética y el comportamiento? ¿Por qué encontraron tres mutaciones del mismo gen y ninguna mutación de otros genes? ¿Es este comportamiento controlado por un solo gen? ¿Pueden estar todos los comportamientos controlados por genes individuales?
Konopka y Benzer señalaron acertadamente en su publicación que los comportamientos están regulados por muchos genes y que es probable que Period sea un componente central del mecanismo de oscilación del reloj interno, pero no el único. Su metodología tenía como objetivo encontrar componentes que afectaran drásticamente el reloj, componentes que lo rompieran. Tenía que haber otros componentes incluso con una función menos drástica o central.
Como Hirsch ya había demostrado, el componente genético de los comportamientos incluye muchas regiones del genoma. Esos son genes y regiones reguladoras del ADN que producen muchas proteínas y ARN de diferentes tipos que interactúan entre sí de diferentes maneras. Algunos de ellos son fundamentales para esos mecanismos y otros tienen funciones más sutiles.
El trabajo de Benzer y Konopka fue la base para el estudio de los componentes genéticos, celulares y moleculares del sistema nervioso y como controlan los comportamientos, un campo ahora llamado neurogenética. También fundaron el estudio de los componentes de los relojes biológicos.
Más tarde, se descubrieron muchos más elementos del reloj circadiano y se describieron los mecanismos de su función (Rosbash, Hall y Young recibieron el Premio Nobel en 2017 por esos estudios). Es un campo que aún produce sorprendentes descubrimientos que seguiremos explorando.
Los comportamientos están influenciados por la genética y por factores ambientales. El estudio del reloj interno ha mostrado muchos componentes moleculares y celulares que funcionan como sensores de factores ambientales, como la luz o la temperatura, para modular aspectos de su función.
Benzer y su laboratorio no se detuvieron en Period, y continuaron descubriendo genes involucrados en comportamientos durante muchas décadas. Además, su enfoque de genética directa sería la base de muchos grandes descubrimientos en otros campos.
Sólo hace falta encontrar un fenómeno biológico, encontrar una forma controlada de medirlo en el laboratorio, mutar genes y finalmente encontrar mutantes para el fenómeno (¡y luego trabajar por muchos años!).
¿Se te ocurre algún fenómeno que te gustaría estudiar de esta manera? ¿Como lo harías? ¿Cómo combinarías el descubrimiento de Benzer y Konopka con las técnicas de transgénesis y expresión génica? ¿Podrían usarse estas metodologías para investigaciones relacionadas con enfermedades?
¡Recuerda todo lo que puedes hacer con las moscas!
¡Hasta la próxima!
Referencias Interesantes
Benzer falleció en el año 2007. Después de su muerte se escribieron muchos tributos. Para este texto usé varios de estos relatos sobre la vida y trabajo de Benzer (Greenspan R, Current Biology, 2007, vol 18(3) R106-R110;Vosshall LB, Nature, 2007, vol 450(8) pp193-197; Bonini NM, Genetics, 2008, vol 180 pp1265–1273).
También consulté los capítulos relevantes de un lindo libro sobre la vida de Benzer –Time, Love, Memory: A Great Biologist and His Quest for the Origins of Behavior (1999) by Jonathan Weiner– Lo recomiendo porque está escrito para el publico general al que le interesan los temas científicos. Para ese libro el autor entrevistó a Benzer u a sus colaboradores. El libro está lleno de anécdotas y detalles interesantes sobre sus descubrimientos.
También recomiendo un articulo que escribió Benzer para Scientific American en 1973 sobre sus descubrimientos (Genetic Dissection of Behavior, Sci Am, 1973, 229 pp 24–37). Tiene muy lindas ilustraciones y fotos en el estilo de la época (muy lindos dibujos técnicos).Y por supuesto, recomiendo leer los papers y tesis originales de Benzer y Konopka (Benzer S, PNAS (1967), vol. 58 pp1112–1119; Konopka RJ and Benzer S, PNAS (1971) vol 68(9) pp 2112-2116; Circadian Clock Mutants of Drosophila melanogaster thesis by RJ Konopka, California Insitute of Technology, 1972).
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